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基因组DNA提取的实验原理和实验流程
发布时间:2021-01-18 点击量:45
   基因组DNA提取实验原理:基因表达的半定量PCR检测,真核细胞含有三类基本RNA:核糖体RNA、信使RNA、转移RNA。其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息,是蛋白质生物合成的中间环节,具有特殊意义。Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA,将其中的mRNA逆转录成cDNA,以一对特异性引物对目的cDNA进行聚合酶链式反应扩增。
 
  基因组DNA提取的实验流程:
  1、研钵以液氮预冷,将适量玉米幼苗新鲜叶片置于研钵中,倒入液氮,迅速研磨至粉末级,研磨期间加入液氮,防止研磨过程中DNA被内源DNA酶降解;
 
  2、将研磨好的粉末移入灭菌后的50mL抽提试管中,用移液管加入10mL月桂酸钠抽提缓冲液,反复缓慢的摇匀;
 
  3、向上述抽提管中加入3ulRNA酶,37℃放置30分钟;
 
  4、用移液管向50mL抽提试管中加入等体积酚:异戊醇,反复缓慢的摇匀;
 
  5、室温离心15min后取出,小心吸取上清液9mL于新灭菌的50ml抽提试管中;
 
  6、向上述抽提试管中加入0.7倍体积异丙醇,上下缓慢颠倒数次,有白色絮状沉淀析出,颠倒时注意往一个方向,防止沉淀散开,不利于后续实验;
 
  7、将白色絮状沉淀用枪头从抽提试管中轻轻挑出,至于1.5mLEP管中;
 
  8、向上述1.5mLEP管中加入1mL75%乙醇,反复轻轻震荡洗涤,室温,高速离心5min,弃上清,重复此步骤两次;
 
  9、将得到的白色沉淀再次室温,短暂离心数秒,取出后,用移液器吸干残留乙醇;
 
  10、白色沉淀置于37°C干燥箱中,使残存的75%乙醇全部挥发干净,这个过程中要经常拿出观察,防止过度烘干,不利于后面溶解;
 
  11、待白色沉淀变透明后,向1.5mLEP管中加入0.4mLTE缓冲液,放置于65℃恒温箱中,期间轻微弹匀,使DNA充分溶解;
 
  12、DNA完全溶解后,以1%琼脂糖胶检测是否有RNA残留,检测合格后,分装,保存于冰箱中。
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