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细胞RNA提取的实验提取步骤
发布时间:2020-01-15 点击量:176
  细胞RNA提取的实验提取步骤:
  标准细胞RNA提取步骤为液氮研磨--加入RNA裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。
  1.将细胞培养皿置于冰上,加入RNA裂解5-10分钟,用枪头轻轻吹打后吸取液体放入进口EP管中。
 
  2.加入1/5体积的氯仿,上下混匀液体,4度静置10-15分钟。(氯仿为有机溶剂,有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和RNA脱离,RNA进入水相)。
 
  3.4度离心15分钟,一定注意选择低温离心。离心后分成三层,RNA在上清里,从离心机轻轻拿出EP管,以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定要动作轻柔,切忌吸取太多,一般吸到400-500ul,避免吸到下层沉淀,将液体置于新的EP管中。
 
  4.加入等体积异丙醇,4度静置10min,然后12000rpm离心10min。异丙醇主要用于沉淀RNA。
 
  5.取出EP管后可以见到侧壁沉淀,轻轻吸弃上清。
 
  6.向EP管中加入75%酒精洗涤沉淀,帮助分离剩余的有机试剂(剩余有机试剂过多会影响OD值和PCR反应),轻弹沉淀,使其浮在酒精,静置1-2min,让酒精充分接触沉淀,充分溶解有机试剂,然后4度离心5min。轻轻吸弃上清。
 
  7.将EP管再次放于离心机中瞬时离心,弃掉管壁残余液体。然后将EP管置于超净台中干燥5-10min.。注意RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。
 
  8.加入50ulDEPC处理水,震荡充分溶解沉淀。
 
  9.测量RNA浓度。将RNA保存于-80度。
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