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多重PCR设计引物应遵循哪些原则
发布时间:2021-03-26 点击量:11
   多重PCR的特点:
  高效性:能在同一PCR反应管内同时检测多种病原微生物,或对有多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可以检测多种病原体;
 
  系统性:很适合对成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠道致病性细菌,性病,感染性细菌等;
 
  经济便捷性:同时检测多种类型的病原可大大节省时间,节省成本,减少实验的复杂性。
 
  多重PCR设计引物应遵循以下原则:
  ①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
 
  ②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
 
  ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
  ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
 
  ⑤引物3'端的碱基,特别是较末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
 
  ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
 
  ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

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